微生物菌種可以采用凍干法進(jìn)行保存。凍干法制備的菌種具有保存周期長(zhǎng)，易活化，保存存活率高。具體方法步驟如下：
1、準(zhǔn)備安瓿瓶用于真空冷凍菌種保藏。安瓿瓶宜采用中性玻璃制造，形狀可用長(zhǎng)頸球形底的。大小要求外徑6~7.5mm,長(zhǎng)105 mm,球部直徑9~11 mm,壁厚0.6~1.2 mm,也可用沒(méi)有球部的管狀安培管。先用2%鹽酸浸泡8~10h,再經(jīng)自來(lái)水沖洗多次,用蒸餾水涮洗2~3次,烘干;在每管內(nèi)放入打好菌號(hào)及日期的標(biāo)簽,字面朝向管壁,管口塞好脫脂棉塞,121℃下高壓滅菌20分鐘，備用。
2、準(zhǔn)備菌種：用真空冷凍干燥法保藏的菌種保藏期可長(zhǎng)達(dá)幾年甚至幾十年。為了活性高，保存期長(zhǎng)，所用菌種純度要高，而且菌齡要適宜。細(xì)菌和酵母菌的菌齡要求超過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，若用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種進(jìn)行保藏，其存活期反而降低。一般細(xì)菌的菌齡要求24~48h。酵母菌為3d，形成孢子的微生物則宜保藏孢子。放線菌和絲狀真菌菌齡為7~10d。
3、保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備：選取新鮮牛奶作為保護(hù)劑，牛奶采用脫脂牛奶，用離心方法去除上層油脂，115℃下高壓蒸汽滅菌25min,備用。或者采用微生物專用凍干保護(hù)劑配方可以保持更高的活性。我公司針對(duì)微生物凍干開(kāi)發(fā)保護(hù)劑，確保微生物高活性凍干。
4、菌種準(zhǔn)備及分裝菌種：每支長(zhǎng)好的斜面加2~3ml保護(hù)劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養(yǎng)基，制成菌懸液。如用液體培養(yǎng)的菌種,則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集的菌體用保護(hù)劑懸浮制成菌懸液。懸液中菌數(shù)要求達(dá)到108~1010個(gè)/ml為宜。懸液制備完成盡快分裝和凍結(jié)。分裝安瓿時(shí)可用滅菌滴入安瓿管底部，每管分裝量約0.1~0.2毫升，分裝安瓿管時(shí)間盡量要短，最好在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作。
5、預(yù)凍-80℃冰箱預(yù)凍1~2小時(shí)或者在凍干機(jī)內(nèi)預(yù)凍3-6個(gè)小時(shí)。
6、冷凍干燥：將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開(kāi)始冷凍干燥，時(shí)間一般為8-20小時(shí)。終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷:①安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀;②真空度接近空載時(shí)的極限真空。③選用1-2支對(duì)照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結(jié)。
7、封口抽真空干燥后，取出安培瓶，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管繼續(xù)抽氣,約10min即可達(dá)到26.7Pa(0.2mmHg。于真空狀態(tài)下,以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安培管頸中央進(jìn)行封口。
8、保藏安瓿管保藏在-20℃冰箱里。
9、凍干法保存的菌種活化：如果要從中取出菌種恢復(fù)培養(yǎng),可先用75%酒精將管的外壁消毒，用鑷子敲下已開(kāi)裂的安瓿管的頂端，使管子破裂，在安瓿管中加入0.5~1ml液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿管，使凍干菌種復(fù)水，然后直接接種到瓊脂斜面或涂布平板。凍干法保存的菌種方便活化，活性高。
